Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг

Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d ), %, Р = 0,95

Стандартное отклонение повторяемости (s r ), %

Предел повторяемости (r ), %

Полнота извлечения веществ, %

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы

4.1 . Средства измерений

4.2 . Вспомогательное оборудование

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный	ТУ 64-1-2451
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный	ТУ 25-11917
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до 350 °С	ТУ 16-531.639
Холодильник бытовой
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр	ТУ 46-22-236-79
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем	ТУ 25-11.834-80
Колбы плоскодонные конические на 250 см 3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см 3
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1000 см 3 тип 2-100-2,2-500-2
Воронки лабораторные
Колбы грушевидные на 10 см 3 с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

4.3 . Реактивы и материалы

Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, 2-водный, чда
Натрий хлорид, хч
Ацетонитрил, осч, сорт 0
Метанол, осч
Кислота фосфорная, осч	ТУ 2612-014-00203677-97
Кислота уксусная ледяная, хч
Толуол, чда
Иммуноаффинные колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобритания)

. Подготовка к выполнению измерений

5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см 3 , приливают 50 см 3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д 333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

Далее 5 см 3 стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол-уксусная кислота (98: 2 % об.) до объема 100 см 3 , получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см 3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 10 - 20 см 3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3 . Приготовление смесей растворителей

Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1 . Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;

«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;

«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;

«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2 . Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1 . Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см 3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см 3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.

6.2.2 . Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см 3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см 3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).

. Выполнение измерений

7.1 . Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2 . Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см 3 /мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

. Обработка результатов измерения

8.1 . Построение градуированной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2 . Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:

С (охр. А) - концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;

М - масса навески для анализа, г (25,0);

т - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

V 1 - объём раствора для экстракции, см 3 (100);

D - граница абсолютной погрешности:

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

8.3 . Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R ) определяют на основании предела повторяемости (r ) (табл. 1):

R = 0,01 (r , %) × , мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (С (отр.А) ) и пробы с добавкой (С ¢ (отр.А) ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т, д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (С ¢ (охр.А) ), пробы без добавки (С (охр.А) ) и величиной добавки (С доб(охр.А) ) с нормативом оперативного контроля (K ). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р и

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С.

Атмосферное давление 730 - 760 мм рт.ст.

Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ВИНО И ВИНОМАТЕРИАЛЫ

Определение содержания охратоксина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Издание официальное

Стандартинформ

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Обществом с ограниченной ответственностью «Люмэкс-маркетикг» (ООО «ЛюмэкС"Маркетинг»)

2 ВНЕСЁН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстаидарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 18 июня 2015 г. Ne 47)

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 июля 2015 г. № 948-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33287-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информаций об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе кНациональные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВИНО И ВИНОМАТЕРИАЛЫ

Определение содержания охратоксика А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Wine and wine materials.

Determination of ochratoxin A content by high performance liquid chromatography

Дата введения - 2017-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на вино и еиноматериалы и устанавливает метод определения массовой концентрации охратоксина А при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой концентрации охратоксина А составляет от 0.001 до 0.1 мг/дм 3 .

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезоласность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-63. ИСО 4788-60) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725*6-2003° Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры ГОСТ 29227-91 (ИСО 835*1-61) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31730-2012 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов е информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному

"" В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность {правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».

указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты)» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор и подготовка пробы к испытанию

Отбор проб по ГОСТ 31730.

Вина с повышенным содержанием диоксида углерода предварительно дегазируют. Для этого 50 см 3 продукта помещают в колбу с тубусом вместимостью 100 см 3 (см. 6.22), встряхивают и подключают к вакуумному насосу (см. 6.6). Дегазируют в течение 10-15 мин до исчезновения пены и появления больших пузырей на поверхности жидкости.

4 Требования безопасности

При проведении измерений следует соблюдать требования:

Электробеэопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и технической документации на хроматограф:

Еэрыеобезоласности в соответствии с ГОСТ 12.1.010;

Пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004;

Безопасности при работе с вредными веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Охратоксин А вызывает поражение почек и печени и

предположительно является канцерогеном. Все работы, связанные с подготовкой пробы и приготовлением растворов охратоксина А, следует проводить в вытяжном шкафу с использованием защитной одежды, перчаток и защитных очков. Деконтаминацию стеклянной посуды, контактировавшей с охратоксином А, проводят 4 %-ным раствором гипохлорита натрия.

5 Сущность метода

Метод основан на экстракции охратоксина А из пробы подкисленным хлористым метиленом, концентрировании полученного экстракта, скрининге проб и определении массовой концентрации охратоксина А с применением ВЭЖХ на обращеннскразовой колонке с флуориметрическим детектированием.

6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы, посуда и материалы

6.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим или спсктрофлуоримстричсским детектором, обеспечивающим возбуждение флуоресценции в спектральной области (330 ± 20) нм и регистрацию интенсивности флуоресценции в спектральной области (465 ± 20) нм. Применяемый детектор должен обеспечивать предел обнаружения охратоксина А не более 5 нг/см 3 .

6.2 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0.01 г.

6.3 Колонка хроматографическая аналитическая, заполненная обращенно-фаэоеым сорбентом с размером частиц 5 мкм. имеющая эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику охратоксина А"\

6.4 Предколонка того же внутреннего диаметра и заполненная тем же обращенно-фаэоеым сорбентом, что и аналитическая колонка.

6.5 Испаритель ротационный, снабженный водяной баней с регулятором температуры в диапазоне от 20 “С до 50 °С.

6.6 Насос лабораторный вакуумный, мембранный или водоструйный по ГОСТ 25336, обеспечивающий разрежение от 2.5 до 10 кПа.

0 Пример коммерческого продукта, удовлетворяющего указанным требованиям. - хроматографическая колонка внутренним диаметром 2.1 мм и длиной 120 мм. заполненная обращенно-фаэоеым сорбентом Кромасил С-18. Alltfcna С18 и др. с размером частиц 5 мкм. снабженная предкопонкой длиной 25 мм. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.

6.7 Шкаф сушильный, обеспечивающий температуру до 200 в С.

6.8 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

6.9 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.

6.10 Межгосударственный или метрологически обеспеченный в национальной системе измерений государства, принявшего стандарт, государственный стандартный образец 1 " состава раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 50 мкг/см 3 с погрешностью аттестованного значения не более ± 2.5 мкг/см 3 . Допускается применение стандартных образцов состава раствора охратоксина А в других растворителях, что должно быть учтено при приготовлении исходного раствора по 7.3.1.

6.11 вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.

6.12 Кислота уксусная по ГОСТ 61. ледяная.

6.13 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, оптическая плотность относительно дистиллированной воды при 200 нм не более 0.025, массовая доля воды не более 0.03 %.

6.14 Хлористый метилен для высокоэффективной жидкостной хроматографии по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

6.15 Кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч. или ч. д. а.

8.16 Натрий хлористый по ГОСТ 4233. х. ч.

6.17 Пипетки градуированные 1-2-2-1. 1-2-2-2. 1-2*2*5, 1-2-2-10 или других типов и исполнений по ГОСТ 29227.

6.18 Цилиндры мерные 1-25-2.1-50-2,1-250-2 или других исполнений по ГОСТ 1770.

6.19 Колбы мерные 2-25-2. 2-50-2.2-100-2. 2-500-2 по ГОСТ 1770.

6.20 Колбы остродонные 0-10-14/23 и 0-50-14/23 по ГОСТ 25336.

6.21 Колбы плоскодонные П-1-50-29/32, П-1-10О-29/32. П-1-20О-29/32. П-1-250-29/32 или Кн-1-50-29/32. Кн-1-100-29/32. Кн-1 -250-29/32 по ГОСТ 25336.

6.22 Колбы с тубусом 2-100-19/26.2-250-29/32 по ГОСТ 25336.

6.23 Воронки делительные типа ВД исполнений 1 или 3 вместимостью 50 см 3 по ГОСТ 25336.

6.24 Воронки лабораторные типа В по ГОСТ 25336.

6.25 Фильтры бумажные «красная лента» по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

6.26 Стеклянные емкости вместимостью 25. 50. 250, 1000 см 3 с пришлифованными стеклянными, фторопластовыми или полиэтиленовыми пробками по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

6.27 Часы песочные или таймер по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не хуже вышеуказанных и вспомогательного оборудования, реактивов и материалов с техническими характеристиками не хуже вышеуказанных.

7 Подготовка к проведению испытания

7.1 Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы обрабатывают только серной кислотой по 6.15 без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой.

Остальную стеклянную посуду обрабатывают горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 X.

7.2 Приготовление вспомогательных растворов

7.2.1 Приготовление подвижной фазы

8 заранее подготовленную стеклянную емкость вместимостью 1000 см 3 с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой помещают 5 см 3 ледяной уксусной кислоты (см. 6.12), 215 см 3 ацетонитрила (см. 6.13) и 280 см 3 дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают. При хранении подвижной фазы недопустимо использование резиновых или корковых пробок.

Срок хранения смеси при комнатной температуре - не более 1 мес.

Перед применением подвижную фазу дегазируют и фильтруют в соответствии с рекомендациями изготовителя хроматографа.

" В Российской Федерации - стандартный образец утвержденного типа.

7.2.2 Приготовление смеси хлористого метилена и уксусной кислоты в объемном соотношении 200:1

В плоскодонную колбу вместимостью 250 см 3 помещают 200 см 3 хлористого метилена (см. 6.14) и 1.0 см 3 ледяной уксусной кислоты (см. 6.12).

Срок хранения смеси при комнатной температуре в стеклянной емкости с пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой - не болев 1 мес.

7.2.3 Приготовление раствора хлористого натрия с массовой долей 20 %.

В плоскодонную колбу вместимостью 200 см 3 помещают 20 г хлористого натрия (см. 6.16), приливают 80 см 3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 3 мес.

7.3 Приготовление растворов охратоксина А

7.3.1 Приготовление исходного раствора охратоксина А с номинальным значением массовой концентрации 1 мкг/см 3

Пипеткой отбирают 1 см 3 стандартного образца состава раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 50 мкг/см 3 (см. 6.10). помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 и доводят объем до метки ацетонитрилом (см. 6.13).

Срок хранения приготовленного раствора в холодильнике при температуре от 2 °С до 6 *С - не более 6 мес.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в исходном растворе (См, мкг/см 3) вычисляют по формуле

где Ссо - аттестованное значение массовой концентрации охратоксина А в стандартном образце по паспорту, мкг/см 3 ;

Vco - объем стандартного образца состава раствора охратоксина А. отобранный для приготовления исходного раствора, см 3 (1 см 3);

V^, - объем мерной колбы, использованной для приготовления исходною раствора, см 3 (50 см 3).

Примечание - При использовании стандартного образца состава раствора охратоксина А в других растворителях аликвоту (1 см 3 } упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 "С до 45 *С или в токе азота. Сухой остаток растворяют в 2 см 1 ацетонитрила и перемешивают в течение 1 мин. Затем полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 и разбавляют до метки ацетонитрилом.

7.3.2 Приготовление раствора охратоксина А в подвижной фазе с номинальным значением массовой концентрации 50 нг/см }

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 2.5 см 3 исходного раствора охратоксина А по 7.3.1 и доводят объем до метки подвижной фазой по 7.2.1.

Срок хранения полученного раствора в холодильнике при температуре от 2 е С до 6 и С - не более 3 мес.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в растворе (Со, нг/см 3) вычисляют по формуле

С„ = r ~, ; v ~ -10QQ. (2)

где См, - фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в исходном растворе (см. 7.3.1), мкг/см 3 ;

Объем исходного раствора по 7.3.1. отобранный для приготовления данного раствора. см 3 (2.5 см 3);

Vo - объем мерной колбы, использованной для приготовления исходного раствора, см 3 (50 см 3);

1000 - коэффициент согласования размерности единиц массы.

7.3.3 Приготовление градуировочных растворов охратоксина А

Исходный раствор охратоксина А в ацетонитриле по 7.3.1 помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 . Объем раствора охратоксина А должен соответствовал» требованиям таблицы 1.

Таблица 1

Содержимое колбы разбавляют до метки подвижкой фазой по 7.2.1 в соответствии с таблицей 1.

Срок хранения градуировочных растворов в холодильнике при температуре от 2 С С до 6 °С - не более семи дней.

Примечание - При необходимости, например для внесения добавки охрагоксина А в пробу (см. 8.2). допускается приготовление аналогичным способом растворов охратоксина А других концентраций.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в градуировочных растворах вычисляют по формуле (2). исходя из значений объемов исходного раствора по таблице 1.

Перед использованием растворы выдерживают до достижения комнатной температуры.

7.4 Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации.

Устанавливают рабочие длины волн возбуждения и регистрации флуоресценции (см. 6.1). Объемную скорость подачи подвижной фазы и объем дозирования пробы задают в зависимости от типоразмеров колонки, руководствуясь указаниями изготовителя хроматографа и колонки. Например, для хроматографической колонки, приведенной в 6.3. рекомендуются значение объемной скорости 200 мм 3 /мин и объем петли крана-дозатора от 10 до 20 мм\ При наличии термостата колонок устанавливают температуру (25 ± 1) °С.

7.5 Градуировка хроматографа

Диапазон линейности градуировочной характеристики составляет от 5 до 100 нг/см*. В качестве образцов для градуировки хроматографа используют градуировочные растворы охратоксина А no 7.3.3.

Регистрируют по две хроматограммы каждого градуировочного раствора и, используя программное обеспечение к хроматографу, проводят градуировку хроматографа, устанавливая параметры градуировочной характеристики и время удерживания охратоксина А.

Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации охратоксина А в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.3.3).

Градуировку считают приемлемой, если:

Коэффициент корреляции не менее 0.998:

Относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации охратоксина А от фактического значения не более ± 10 %.

7.6 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работы.

8 качестве контрольного раствора используют раствор охратоксина А в подвижной фазе, приготовленный аналогично 7.3.3. Массовую концентрацию охратоксина А в контрольном растворе выбирают, исходя из предполагаемого содержания охратоксина А в испытуемых пробах: рекомендуется использование раствора охратоксина А массовой концентрации 20 нг/см э.

Регистрируют не менее двух хроматограмм контрольного раствора и идентифицируют пик охратоксина А по времени удерживания при ширине окна идентификации 5 %. внося при необходимости программную коррекцию времени удерживания пика, и при помощи градуировочной характеристики рассчитывают массовую концентрацию охратоксина А для каждого ввода.

Повторяемость значений времени удерживания и значений массовой концентрации охратоксина А проверяют по формулам

l^Z^lisO.05, (3)

где h и Гг - значения времени удерживания пика охратоксина А на первой и второй хроматограммах соответственно, мин:

f - среднеарифметическое значение /, и t 2 , мин.

я, _ »»*0Л7»

с.

где Сщ и Сл2 - массовые концентрации охратоксина А в контрольном растворе по первой и второй хроматограммам соответственно, нг/см 3 ;

С к - среднеарифметическое значений Cxi и С«. нг/см 3 .

Градуировочная зависимость признается стабильной, если выполняется условие где С - фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в контрольном растворе, нг/см 3 -

Если условие (5) не выполняется, то процедуру контроля повторяют. Результаты повторного контроля считают окончательными, и градуировку хроматографа по 7.5 проводят заново.

7.7 Контроль холостой пробы

Испытание холостой пробы проводят перед испытанием исследуемых проб.

В колбу для упаривания помещают 15 см* смеси хлористого метилена и уксусной кислоты по

7.2.2 и упаривают в вакууме до сухого остатка, поместив колбу в водяную баню при температуре от 40 ’С до 45 ’С.

Сухой остаток растворяют в 0.5 см* подвижной фазы по 7.2.1. выдерживают не менее 5 мин и проводят хроматографический анализ полученного концентрата по 8.3. Если на хроматограмме присутствуют пики, по времени удерживания близкие к пику охратоксина А, то находят и устраняют причины загрязнения холостой пробы.

Примечание - Наиболее распространенной причиной неудовлетворительного результата контроля холостой пробы является недостаточная чистота хлористого метилена, который может быть загрязнен примесями, имеющими близкие к охратоксину А значения времени удерживания. Такой хлористый метилен необходимо заменить или подвергнуть тщатегъной перегонке, собирая среднюю фракцию с температурой кипения от 39 *С до 40 *С.

8 Проведение испытания

8.1 Экстракция охратоксина А из пробы

В делительную воронку помещают пипеткой 5 см 3 пробы, добавляют 5 см 3 раствора хлористого натрия ло 7.2.3, приливают 5 см 3 смеси хлористого метилена и уксусной кислоты по 7.2.2 и встряхивают в течение 1 мин. После расслоения фаз нижний органический слой фильтруют через предварительно смоченный подкисленным хлористым метиленом фильтр ккрасная лента» в колбу для упаривания.

Примечание - При образовании стойкой эмульсии рекомендуется центрифугировать смесь в течение 2 мин при частоте вращения 5000 об/мин.

Повторяют экстракцию охратоксина А из верхнего слоя еще раз 5 см 3 смеси уксусной кислоты и хлористого метилена по 7.2.2. Полученный экстракт фильтруют в ту же колбу для упаривания.

Фильтр промывают подкисленным хлористым метиленом объемом от 5 до 10 см 3 . Экстракт упаривают до сухого остатка в вакууме, поместив колбу в водяную баню при температуре от 40 в С до 45 *С. Сухой остаток растворяют в 0.5 см* подвижной фазы, получая таким образом концентрат пробы.

Примечание -На стадии освоения метода, при смене партии экстрагента, а также при возникновении сомнений в достоверности получаемых результатов находят коэффициент прохождения охратоксина А в контрольной пробе в соответствии с приложением А и проверяют приемлемость полученного значения.

8.2 Проведение скрининга проб

Концентрат пробы вина, полученный по 8.1. выдерживают не менее 5 мин. и затем проводят его хроматографический анализ по 8.3.

При отсутствии на хроматограмме пика, идентифицируемого как пик охратоксина А. делают вывод об отсутствии охратоксина А в пробе на уровне нижней границы диапазона измерений (0.001 мг/дм 3) и пробу с добавкой охратоксина А не готовят.

Если на хроматограмме пробы обнаруживают пик. идентифицируемый программным обеспечением к хроматографу как пик охратоксина А (см. 8.3). то е анализируемую пробу вносят

добавку в виде раствора охратоксина А в подвижной фазе (см. 7.3.2). Рекомендуемый объем добавки раствора охратоксина A (V 4P . см 3) вычисляют по формуле

(6) где о - коэффициент, значение которого выбирают в диапазоне от 0.5 до 2.0:

С* - массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы (см.8.3). нг/см 3 ;

Ус- объем концентрата пробы, см 3 (0.5 см 3);

Сет - массовая концентрация охратоксина А в растворе, используемом для внесения добавки. нг/см 3 .

Объем вносимой добавки не должен превышать 5 % объема пробы (У пр. см 3). Если это требование не согласуется со значениями, рассчитанными по формуле (6). то для внесения добавки охратоксина А используют раствор с другим значением массовой концентрации.

Пробу с добавкой анализируют согласно 8.1.

8.3 Проведение хроматографических измерений

Регистрируют не менее двух хроматограмм концентрата испытуемой пробы (см. 8.1) и пробы с добавкой (см. 8.2), в тех же условиях, при которых была проведена градуировка хроматографа. Идентификацию охратоксина А проводят по совпадению времени удерживания охратоксина А в экстракте пробы с его временем удерживания, полученным при контроле стабильности градуировочной характеристики, установив ширину окна идентификации 5 %.

Пример хроматограммы приведен на рисунке Б.1 (приложение Б).

Примечание - При необходимости подтверждения правильности идентификации пика охратоксина А рекомендуется выполнить добавку раствора охратоксина А в подвижной фазе к концентрату пробы. О достоверности идентификации можно судить по увеличению высоты предполагаемого пика охратоксина А Количество добавляемого раствора охратоксина А определяют, исходя из того, что массовая концентрация охратоксина А в пробе должна увеличиться на (50 - 150) % по сравнению с исходным значением.

При наличии на хроматограмме концентрата пробы пика, идентифицированного как пик охратоксина А. вычисляют значение массовой концентрации охратоксина А в концентрате пробы для каждой зарегистрированной хроматограммы с использованием градуировочной характеристики, установленной по 7.5. и проверяют приемлемость полученных значений, используя условие (4). Если условие (4) выполняется, то в качестве результата измерений массовой концентрации охратоксина А в концентрате испытуемой пробы принимают среднеарифметическое значение полученных концентраций (Сх. нг/см 3). Если условие (4) не выполняется, то находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод концентрата пробы повторяют.

При анализе концентрата пробы с добавкой охратоксина А (см. 8.2) также регистрируют две хроматограммы, идентифицируют пик охратоксина А и рассчитывают значение массовой концентрации охратоксина в концентрате по каждой хроматограмме, проверяют приемлемость полученных значений и рассчитывают массовую концентрацию охратоксина А в концентрате пробы с добавкой (С Х 4 Д. нг/дм 3) как среднеарифметическое значение полученных значений.

Если массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы превышает 100 нг/см 3 , то пробу вина разбавляют водой по 6.11 и разбавленную пробу анализируют заново по 8.1. Коэффициент разбавления О вычисляют по формуле

где У р - объем разбавленной пробы, см 3 ;

У 4 - объем аликвоты испытуемой пробы, взятый для разбавления, см 3 .

9 Обработка результатов испытания

Массовую концентрацию охратоксина А в пробе вина (X. мг/дм) вычисляют по формуле

V---ц--:--о-ю ’

где С ст - массовая концентрация раствора охратоксина А. использованного в качестве добавки (см. 8.2). нг/см 3:

Объем добавки раствора охратоксина А к пробе (см. 8.2), см 3:

Урр - объем пробы, взятой для испытаний по 8.1. см 3 (5см 3);

С х - массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы (см. 8.3), нг/см 3:

С х. в ~ массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы с добавкой (см. 8.3). нг/см 3:

О - коэффициент разбавления пробы вина (см. 8.3). Если разбавление пробы не производили, то О г 1;

10" 3 - коэффициент согласования размерности единиц массы и объема.

10 Метрологические характеристики

Метод обеслечивает получение результатов измерений с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, приведенных в таблице 2.

Таблица 2

Диапазон измерений. мг/дм 1	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в условиях повторяемости при Р * 0,95) г 0 ,„ . %	Критическая разность (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными е условиях воспроизводимости при Р = 0.951 С0% V. кг/дм 1	Показатель точности (границы* относительной погрешности при доверительной вероятности Р = 0.95).
От 0.001 до 0.005 включ.
Се. 0.005 » 0.1 »
* Установленные числовые значения границ относительной погрешности соответствуют числовым значениям относительной расширенной неопределенности при коэффициенте охвата к = 2.

Расхождение между двумя результатами измерений (Х| и Х 2 , мг/дм - *). полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости, должно соответствовать условию

где X - среднее арифметическое X, и Х 2 . мг/дм:

Л>п. - предел повторяемости (таблица 2), %.

При выполнении условия (9) за результат измерений принимают среднеарифметическое полученных результатов измерений (X, и Х 2 . мг/дм 3).

Расхождение между двумя результатами измерений, полученными в двух лабораториях (Х 1гаС и Хане, мг/дм 3) на идентичных пробах, должно соответствовать условию

где Хпов - среднее арифметическое Х 1лв0 и Х^. мг/дм 3: СО 095 - критическая разность (таблица 2). %.

11 Контроль качества результатов измерений

Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с учетом требований ГОСТ ИСО 5725*6 (раздел 6).

12 Оформление результатов испытания

Результаты испытаний регистрируют в протоколе испытаний, который оформляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом протокол испытаний должен содержать ссылку на настоящий стандарт.

Результаты измерений содержания охратоксина А (при подтвержденном в лаборатории соответствии аналитической процедуры требованиям настоящего стандарта) представляют в виде

Х±Л либо Х± U. (11)

где X -результат измерений, полученный в соответствии с разделом 10. мг/дм 3:

А - границы абсолютной погрешности измерений содержания охратоксина А {Р - 0,95), мг/дм 3 , которые вычисляют по формуле

А = 0.0!бГ: (12)

U - расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к-2. мг/дм 3 , которую вычисляют по формуле 8

U = 0.CM (/ w х. {13)

Значения S (U„J приведены в таблице 2.

Числовые значения границ абсолютной погрешности (неопределенности) выражают числом, содержащим не более двух значащих цифр, при этом наименьший разряд числового значения окончательного результата измерений принимают таким же. как и наименьший разряд числового значения границ абсолютной погрешности (неопределенности).

Определение коэффициента прохождения охратоксина А

Для определения коэффициента прохождения охратоксина А используют контрольную пробу, для приготовления которой в делительную воронку помещают 5 см’ дистиллированной воды, добавляют 5 см’ раствора хлористого натрия по 7.2.3 и вносят 0.5 см* раствора охратоксина А массовой концентрации 50 нг/см’ в подвижной фазе (см. 7.3.2).

Проводят экстракцию охратоксина А по 6.1. приготавливают концентрат контрольной пробы по 8.2 и проводят его хроматографический анализ по 8.3 и. используя градуировочную характеристику по 7.5. выделяют массовую концентрацию охратоксина А в концентрате контрольной пробы.

Затем вычисляют коэффициент прохождения охратоксина А (п) по формуле

где V\ - объем концентрата контрольной пробы, см 9 (0.5 см*):

Сх - измеренное значение массовой концентрации охратоксина А в концентрате контрольной пробы, нг/см*:

С. - значение массовой концентрации охратоксина А в растворе по 7.3.2. нг/см*:

V. - объем раствора охратоксина А по 7.3.2. отобранный для приготовления контрольной пробы, см* (0.5

Коэффициент прохождения охратоксина А определяют не менее трех раз в условиях повторяемости. Полученные значения должны соответствовать следующим требованиям:

Каждое из полученных значений не менее 0,8:

Относительное значение размаха полученных значений соответствует условию

I П||Ж Пчии I

где iv«t и tv». - наибольшее и наименьшее из полученных значений коэффициента прохождения охратоксина А: ц - среднеарифметическое полученных значений коэффициента прохождения охратоксина А.

Если оба этих условия выполняются, то проведение операций по 8.1 считают удовлетворительным. В противном случае находят причины потерь охратоксина А и повторяют определение коэффициента прохождения.

Приложение Б (справочное)

Пример хроматограммы

полусладкого

На рисунке Б.1 приведен пример хроматограммы концентрата пробы вина красного (массовая концентрация охратоксина А в пробе 0,0010 мг/дм 1).

концентрации

Рисунок Б.1 - Пример хроматограммы

Пик охратоксина А (на рисунке обозначен как ОТА) соответствует значению массовой охратоксина А в концентрате 7.7 нг/см*.

УДК 543.544.5.068.7:663.2:006.354 МКС 67.160.10

Ключевые слова: вино, виноматериалы. методы испытаний, высокоэффективная жидкостная хроматография, охратоксин А. экстракция охратоксина А. определение массовой концентрации охратоксина А. концентрирование экстракта, скрининг проб, флуориметричесхое детектирование

Редактор К.В. Дудко Корректор П.М. Смирнов Компьютерная еерстка Е.К. Кузиной

Подписано в печать 08.02.2016. Формат 60x84V*.

Уел. печ. л. 1,86. Тираж 45 экз. За*. 3872.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Листовка

Наборы и представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа. Они выпускаются серийно в соответствии с ISO 9000 в комплекте с необходимыми реагентами и предназначены для количественного определения охратоксина в зерновых культурах, кормах, зерновых продуктах, пиве и сыворотке крови. Методические указания по использованию тест-систем RIDASCREEN ® FAST Ochratoxin А и RIDASCREEN ® Ochratoxin A утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству Минсельхоза России за номером МУК 5-1-14/1001. Системы включены в "Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения". Тест-системы RIDASCREEN ® FAST Ochratoxin А соответствуют ГОСТ 34108-2017 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания микотоксинов прямым твердофазным конкурентным иммуноферментным методом".

Определение охратоксина А в зерне, кормах, зерновых продуктах, пиве и сыворотке крови

Охратоксин - это ядовитое вещество, образующееся в результате жизнедеятельности плесневых грибов рода Aspergillus и Penicillium . Наряду с выраженной нефротоксичностью, охратоксин обладает гепатотоксичностью, тератогенными, канцерогенными и иммунодепрессивными свойствами. С продуктами растительного и животного происхождения охратоксин может попадать в организм человека. Он обнаруживается не только в зерновых культурах (13% положительных проб) и кормах для животных, но и в свиной крови (60% положительных проб) и почках (21% положительных проб).

Технический Регламент Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" регламентируют следующий предельный уровень содержания охратоксина А: в продовольственном зерне, крупе, муке - 0,005 мг/кг (5 мкг/кг); в детском питании, продуктах питания для дошкольников и школьников, продуктах для питания беременных и кормящих женщин — не допускается (<0,0005 мг/кг).

Проект федерального закона № 349084-5 "Технический регламент на винодельческую продукцию" устанавливает требования к содержанию в вине охратоксина А не более 0,002 мг/л.

В проект Федерального закона "О требованиях к безопасности пищевых продуктов и процессов их производства, хранения, перевозки, реализации и утилизации" также включено требование обязательного контроля продовольственного зерна на охратоксин А, содержание которого не должно превышать 0,005 мг/кг. С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com .

До недавнего времени для контроля охратоксина применялись преимущественно хроматографические методы (высокоэффективная жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография). Значительно более удобен метод иммуноферментного анализа (ELISA, или ИФА), обладающий очень высокой чувствительностью.

Спецификация:	RIDASCREEN ® FAST Ochratoxin А	RIDASCREEN ® Ochratoxin A 30/15
Формат:	Стрипованный планшет, 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок)	Стрипованный планшет, 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок)
Стандарты:	0 / 5 / 10 / 20 / 40 мкг/л	0 / 50 / 100 / 300 / 900 / 1800 нг/л
Пробоподготовка:	Размол пробы, экстракция, фильтрование	экстракция, центрифугирование/ фильтрование (зерно, корма); экстракция, центрифугирование, фильтрование, встряхивание, переэкстракция, центрифугирование, испарение (пиво/сыворотка крови)
Затраты времени:
Предел обнаружения:	0,005 мг/кг	0,001250 мг/кг (зерно, корма) 0,000050 мг/кг (пиво, сыворотка крови)

Смежные продукты:

Охратоксины вырабатываются некоторыми видами грибов Aspergillus и Penicillium . Основными продуцентами являются A.ochraceus и P.viridicatum . Эти грибы встречаются повсеместно. Aspergillus вырабатывает охратоксины при повышенной температуре и влажности, а Penicillium уже при 5ºС. Охратоксины – соединения высокой токсичности, с ярко выраженным тератогенным эффектом.

Охратоксины А,В, и С представляют собой группу близких по структуре соединений, являющихся изокумаринами, связанными с L -фенилаланином пептидной связью. В зависимости от природы радикалов образуются охратоксины различных типов (табл. 2.3.).

Охратоксин А – бесцветное кристаллическое вещество, слабо растворимое в воде, умеренно растворимое в полярных органических растворителях (метанол, хлороформ), а также в водном растворе карбоната натрия. В химически чистом виде он нестабилен и очень чувствителен к воздействию света и воздуха, однако в растворе этанола может сохраняться без изменений в течение длительного времени. В УФ свете обладает зеленой флуоресценцией.

Охратоксин В – кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора. Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В УФ-свете обладает голубой флуоресценцией.

Охратоксин С – аморфное вещество, этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В У-свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией.

Охратоксины принадлежат к токсичным микотоксинам, обладают высокой токсичностью для печени, почек, тератогенными и иммунодепрессивными свойствами, выраженным гемолитическим эффектом. Из охратоксинов наиболее токсичен охратоксин А (ЛД 50 = 3,4 мг/кг, (однодневные цыплята, перорально)). Он более токсичен, чем афлатоксины. Другие микотоксины этой группы на порядок менее токсичны.

Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы действия охратоксинов изучены недостаточно. Известно, что охратоксин А подавляет синтез протеина и метаболизм углеводов, в частности гликоногеноз, путем ингибирования активности фенилаланин – т-РНК – специфического фермента, играющего ключевую роль в начальной стадии синтеза протеина.

Охратоксин А обнаружен в кукурузе, ячмене, пшенице, овсе, ячмене. Важен и опасен тот факт, что при высоком загрязнении кормового зерна и комбикормов охратоксин А обнаруживается в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). Охратоксин В встречается редко. Охратоксины также поражают все плоды садово-огородных культур. Особенно сильно поражаются яблоки: до 50% урожая может загрязняться микотоксинами.

Следует отметить, что охратоксины являются стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на 32% (при температуре 250–300ºС). Таким образом, распространненость в продуктах питания, токсичность и устойчивость охратоксинов создают реальную опасность для здоровья человека.

Методы анализа

Охратоксин А содержится в окисленных продуктах. Он легко растворяется во многих органических растворителях, что используется для экстракции. Наиболее часто используется экстракция хлороформом и водным раствором фосфорной кислоты с последующей очисткой на колонке и количественное определение с использованием метода ТСХ.

Разработан также метод ВЭЖХ. Перед ВЭЖХ анализом образец готовят следующим образом. Измельченный образец обрабатывают смесью 2 М соляной кислоты и 0,4 М раствора хлорида магния. После гомогенизации экстрагируют толуолом в течение 60 мин. Смесь центрифугируют. Центрифугат пропускают через колонку с силикагелем и промывают смесью толуола с ацетоном (подвижная фаза). Охратоксин А элюируется смесью толуола с уксусной кислотой (9:1) и высушивается при 40°С. Остаток растворяют и фильтруют. Анализ проводят с использованием ВЭЖХ.

Кроме того, разработан ряд биопроб на креветках, бактериях, но полученные результаты не позволили использовать эти методы для определения охратоксинов.



стр. 1

стр. 2

стр. 3

стр. 4

стр. 5

стр. 6

стр. 7

стр. 8

стр. 9

стр. 10

стр. 11

стр. 12

стр. 13

стр. 14

стр. 15

стр. 16

стр. 17

стр. 18

стр. 19

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ЗЕРНО И ПРОДУКТЫ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ, КОМБИКОРМА

Определение охратоксина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(ISO 15141-1:1998, NEQ)

Издание официальное

Стандартинформ

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 -2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Обществом с ограниченной ответственностью «Люмэкс-маркетинг» (ООО «Люмэкс-маркетинг»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. № 44-2013)

4 Настоящий стандарт соответствует основным положениям международного стандарта ISO 15141-1:1998 Foodstuffs - Determination of ochratoxin A in cereals and cereal products - Part 1: High performance liquid chromatographic method with silica gel clean up (Продукты пищевые. Определение содержания охратоксина А в зерне и зерновых продуктах. Часть 1. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с очисткой на силикагеле).

Степень соответствия - неэквивалентная (NEQ)

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 декабря 2013 г. N2 2429-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32587-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Март 2016 г.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

© Стандартинформ, 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии.

Примечание - Приведенные объемы элюирования следует изменить в соответствии со значениями, полученными при определении коэффициента прохождения охратоксина А (см. 5.3.10).

5.4.4 Проведение хроматографических измерений

Регистрируют не менее двух хроматограмм концентрата испытуемой пробы, полученного по 5.4.3, в тех же условиях, при которых была проведена градуировка системы. Идентификацию охратоксина А проводят по совпадению времени удерживания охратоксина А в экстракте пробы с его временем удерживания, полученным при контроле стабильности градуировочной характеристики, установив ширину окна идентификации 5 %.

Пример хроматограммы приведен на рисунке А.1 (приложение А).

При наличии на хроматограмме концентрата пробы пика, идентифицированного как пик охратоксина А, делают вывод о присутствии охратоксина А в пробе, определяют его содержание по каждой зарегистрированной хроматограмме и проверяют расхождение полученных значений между собой, используя формулу (2).

Если условие формулы (2) выполняется, то в качестве результата измерений массовой концентрации охратоксина А в концентрате испытуемой пробы принимают среднеарифметическое значение полученных концентраций. Если условие формулы (2) не выполняется, то находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод концентрата пробы повторяют.

При необходимости подтверждения правильности идентификации пика охратоксина А рекомендуется выполнить добавку раствора охратоксина А в подвижной фазе к концентрату пробы. О достоверности идентификации можно судить по увеличению высоты предполагаемого пика охратоксина А. Количество добавляемого раствора охратоксина А определяют, исходя из того, что массовая доля охратоксина А в пробе должна увеличиться на 50 % -150 % по сравнению с исходным значением.

Если массовая концентрация охратоксина А в конечном концентрате С х превышает 100 нг/см 3 , то его разбавляют подвижной фазой (см. 5.3.2.1). Коэффициент разбавления Q вычисляют по формуле

(8)

где Vp - объем разбавленного концентрата испытуемой пробы, см 3 ;

V a - объем аликвоты исходного концентрата испытуемой пробы, взятый для разбавления,

5.5 Обработка результатов испытаний

Массовую долю охратоксина А в пробе X, млн" 1 , вычисляют по формуле

X= V 1- V 2" C X .Q.10\ (9)

где Vi - объем хлороформа, взятого для экстракции, см 3 (30 см 3);

V 2 - объем конечного концентрата пробы, см 3 (0,5 см 3);

Сх - массовая концентрация охратоксина А в конечном концентрате пробы (см. 5.4.4), нг/см 3 ; V 3 - объем хлороформного экстракта, взятого для испытаний по 5.4.3, см 3 (20 см 3);

/л - масса навески, г;

П - коэффициент прохождения охратоксина А (см. 5.3.10);

Q- коэффициент разбавления концентрата пробы (см. 5.4.4);

5.6 Метрологические характеристики

Метод обеспечивает получение результатов измерений с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, приведенных в таблице 2.

Таблица 2

Диапазон измерений, млн" 1 Предел повторяемости г, млн" 1 Предел воспроизводимости R, млн" 1 Показатель точности (границы** абсолютной погрешности при доверительной вероятности Р = 0,95), ± Д, млн" 1 От 0,0025 до 0,05 включ. Св. 0,05 » 1,0 » X- результат измерений по 5.5, млн-1. ** Установленные числовые значения границ абсолютной погрешности соответствуют числовым значениям расширенной неопределенности U (в абсолютных единицах) при коэффициенте охвата к = 2.

Расхождение между двумя результатами измерений (Х| и Х 2 , млн" 1), полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости, должно соответствовать условию

\Х 1 -Х 2 \ <г, (10)

где г - предел повторяемости, млн" 1 (таблица 2).

При выполнении условия (10) за результат измерений принимают среднеарифметическое полученных результатов измерений (Xj и Х 2 , млн" 1).

Расхождение между двумя результатами измерений, полученными в двух лабораториях (Xi na 6 и Х 2ла б, млн" 1) на идентичных пробах, должно соответствовать условию

где R - предел воспроизводимости, млн" 1 (таблица 2).

5.7 Контроль качества результатов измерений

Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (раздел 6).

I

5.8 Оформление результатов испытаний

Результаты испытаний регистрируют в протоколе испытаний, который оформляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом протокол испытаний должен содержать ссылку на настоящий стандарт.

Результаты измерений содержания охратоксина А (при подтвержденном в лаборатории соответствии аналитической процедуры требованиям настоящего стандарта) представляют в виде

Х±Д, млн" 1 либо X±U, млн" 1 , (12)

где X - результат измерений, полученный в соответствии с 5.6, млн" 1 ;

А - границы абсолютной погрешности измерений содержания охратоксина А (Р = 0,95) по

таблице 2, млн" 1 ;

U - расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к = 2, млн" 1 .

Числовые значение границ абсолютной погрешности (неопределенности) выражают числом, содержащим не более двух значащих цифр, при этом наименьший разряд числового значения окончательного результата измерений принимают таким же, как и наименьший разряд числового значения границ абсолютной погрешности (неопределенности).

6 Метод Б

6.1 Сущность метода

Метод основан на экстракции охратоксина А толуолом после подкисления испытуемой пробы соляной кислотой и добавления хлорида магния для увеличения ионной силы. Экстракт очищают с использованием колонок для твердофазной экстракции, заполненных силикагелем, и определяют содержание охратоксина А методом ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с применением флуоримет-рического детектирования. При необходимости проводят подтверждение идентификации охратоксина А путем дериватизации раствором трифторида бора в метаноле.

6.2 Реактивы

При проведении испытаний используют воду по 5.2.13, реактивы по 5.2.14 - 5.2.17, а также нижеследующие.

6.2.7 Растворитель смешанный № 1: толуол (см. 6.2.3) и уксусная кислота ледяная (см. 5.2.15) в объемном соотношении 99: 1.

6.2.8 Растворитель смешанный № 2: ацетон (см. 6.2.5) и толуол (см. 6.2.3) в объемном соотношении 5: 95.

6.2.9 Растворитель смешанный № 3: толуол (см. 6.2.3) и уксусная кислота ледяная (см. 5.2.15) в объемном соотношении 90: 10.

6.2.10 Подвижная фаза

Смешивают 99 объемных частей ацетонитрила (см. 5.2.16) с 99 объемными частями воды (см.5.2.13) и двумя объемными частями ледяной уксусной кислоты (см. 5.2.15). Перед употреблением подвижную фазу дегазируют.

6.2.11 Трифторид бора, массовая доля основного вещества не менее

6.2.12 Раствор трифторида бора в метаноле, р (BF 3) = 14 г/100 см 3 .

ВНИМАНИЕ! Работать необходимо в хорошо действующем вытяжном шкафу. Следует избегать попадания на кожу, в глаза и органы дыхания.

6.2.13 Охратоксин А в кристаллической форме или в виде ампульного препарата в пленочной форме с массовой долей основного вещества не менее 95 %

6.2.14 Охратоксин А, исходный раствор

Растворяют 1 мг кристаллического охратоксина А (см. 6.2.13) или содержимое ампулы с пленкой, содержащей охратоксин А, в таком объеме смешанного растворителя № 1 (см. 6.2.7), чтобы получить раствор массовой концентрации охратоксина А от 20 до 30 мкг/см 3 .

Для определения точного значения массовой концентрации охратоксина А в основном растворе регистрируют его оптическую плотность в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм с шагом 5 нм в кварцевой кювете с толщиной оптического слоя 1 см по 6.3.2 с использованием спектрофотометра (см. 6.3.1). В качестве раствора сравнения используют смешанный растворитель № 1 по 6.2.7. Идентифицируют точное положение максимума поглощения, регистрируя оптическую плотность вблизи него с шагом 1 нм. Рассчитывают значение массовой концентрации охратоксина А, С исх, мкг/см 3 , по формуле

где А макс - оптическая плотность в максимуме поглощения (в данном случае при 333 нм);

М- молярная масса охратоксина А, г/моль (М=403,8 г/моль);

100 - коэффициент согласования единиц длины и массы; е - молярный коэффициент поглощения охратоксина А в смешанном растворителе № 1, м 2 /моль, (е= 544 м 2 /моль);

/-толщина поглощающего слоя кюветы, см.

6.2.15 Охратоксин А, промежуточный раствор массовой концентрации 1 мкг/см 3 Упаривают досуха в токе азота аликвоту исходного раствора (см. 6.2.14), содержащую 100 мкг охратоксина А, и растворяют в 100 см 3 подвижной фазы (см. 6.2.10). Объем аликвоты вычисляют по формуле:

\/ а - объем аликвоты, см 3 ;

100 - масса охратоксина А, мкг;

Сие* - массовая концентрация исходного раствора охратоксина А по 6.2.14, мкг/см 3 .

Срок хранения раствора в холодильнике при температуре от 2°С до 6°С и регулярном контроле его стабильности - не более 6 мес.

6.2.16 Градуировочные растворы охратоксина А

В мерные колбы вместимостью 100 см 3 помещают 1; 2,5; 4 и 5 см 3 промежуточного раствора охратоксина А (см.6.2.15) и разбавляют до метки подвижной фазой (см. 6.2.10). Массовая концентрация охратоксина А в приготовленных градуировочных растворах составляет 10; 25; 40 и 50 нг/см 3 соответственно, что соответствует массе охратоксина А 0,2; 0,5; 0,8 и 1,0 нг в объеме дозирования 20

6.3 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуда

При проведении испытаний используют средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуду по 5.2.1 - 5.2.2, 5.2.6 - 5.2.11,5.2.21 -5.2.34, а также нижеследующее.

6.3.1 Спектрофотометр, пригодный для измерений в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм и имеющий спектральную ширину полосы не более 2 нм.

6.3.2 Кюветы кварцевые с толщиной поглощающего слоя 1 см, не поглощающие свет в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм.

6.3.3 Пробирки центрифужные, например вместимостью 250 см 3 , выполненные из полиэтилена высокого давления с завинчивающейся крышкой.

6.3.4 Центрифуга с охлаждением, желательно рефрижераторная, для центрифужных пробирок (см. 6.3.3), способная к созданию ускорения не менее 3500 д.

Примечание - Скорость вращения центрифуги, обеспечивающую указанное ускорение, выбирают в соответствии с рекомендациями изготовителя центрифуги.

6.3.5 Колонка для твердофазной экстракции одноразовая, заполненная силикагелем.

После вскрытия упаковки колонку кондиционируют в течение двух часов при температуре 105 °С и хранят над активированным силикагелем с индикатором влажности. Перед использованием через колонку пропускают 10 см 3 толуола (см. 6.2.3). С каждой новой партией колонок проверяют выход охратоксина А. Например, пригодны колонки, выполненные из полипропиленовой трубки вместимостью 3 см 3 , со следующими характеристиками:

Средняя масса силикагеля - 690 мг;

Размер пор - 12,5 нм;

Размер частиц - от 55 до 105 мкм.

6.3.6 Резервуары для растворителей, такие как шприцы вместимостью например 50 см 3 с центральным отверстием и пробкой.

6.3.7 Воронка делительная вместимостью 50 см 3 по ГОСТ 25336 .

6.3.8 Фильтры мембранные для водных растворов, выполненные из политетрафторэтилена, с размером пор 0,45 мкм.

6.3.9 Виалы с обжимной или завинчивающейся крышкой.

6.3.10 Микрошпириц вместимостью 500 мм 3 .

6.3.11 Аппаратура для высокоэффективной жидкостной хроматографии

6.3.11.1 Хроматограф жидкостный по 5.2.1.

Длина...................................................250 мм;

Внутренний диаметр....................................4 мм;

Размер сферических частиц........................5 мкм.

6.3.11.2 Колонка хроматографическая аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм, обеспечивающая разделение пика охратоксина А и остальных пиков до базовой линии 1 со следующими характеристиками:

Примечание - Допускается использование аналитических колонок иных типоразмеров (например длиной от 120 до 150 мм).

6.3.11.3 Предколонка того же внутреннего диаметра и заполненная тем же обращенно-

фазовым сорбентом, что и аналитическая колонка длиной

6.3.11.4 Предколонка того же внутреннего диаметра и заполненная тем же обращенно-фазовым сорбентом, что и аналитическая колонка, например, со следующими характеристиками:

Длина....................................................40 мм;

Внутренний диаметр...................................4 мм;

Размер сферических частиц........................5 мкм.

Примечание - Допускается использование предколонок иных типоразмеров.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

6.4 Проведение испытаний

6.4.1 Общие положения

Испытания должны быть проведены в течение одного рабочего дня.

6.4.2 Экстракция охратоксина А из пробы

Помещают (20,0 ± 0,1) г пробы, подготовленной к испытаниям в соответствии с разделом 3, в центрифужную пробирку (см. 6.3.3). При ожидаемом содержании охратоксина более 0,005 млн" 1 массу пробы уменьшают до 10 г; в противном случае следует принять во внимание возможный риск уменьшения извлечения охратоксина А из пробы.

Последовательно добавляют 30 см 3 раствора соляной кислоты (см. 6.2.1), 50 см 3 раствора хлористого магния (см. 6.2.2), перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 100 см 3 толуола по

Перемешивают в течение 60 мин и затем центрифугируют суспензию. Время центрифугирования зависит от эффективности центрифуги. Центрифугирование проводят при охлаждении для предотвращения потерь толуола. Отбирают аликвоту верхнего (толуольного) слоя объемом 50 см 3 (у 2) и пропускают ее через колонку для твердофазной экстракции, подготовленную по 6.3.5, с подсоединенным к ней резервуаром (см. 6.3.6).

Примечание - Следует принять меры по недопущению перегрузки колонки.

Колонку промывают двумя порциями по 10 см 3 гексана (см. 5.2.17) и затем двумя порциями смешанного растворителя № 2 (см. 6.2.8). Затем промывают 5 см 3 толуола, отбрасывая все элюаты.

Элюируют охратоксин А двумя порциями по 15 см 3 смешанного растворителя № 3 (см. 6.2.9) в остродонную колбу вместимостью 50 см 3 (см. 5.2.25). Объединенный элюат осторожно упаривают до сухого остатка при пониженном давлении и температуре не выше 40 °С. Остаток растворяют в 1 см 3 (\/ 3) подвижной фазы (см. 6.2.10) и переносят в виалу (см. 6.3.9).

Примечания

1 Условия элюирования охратоксина А и последующих операций могут зависеть от типа применяемых колонок для твердофазной экстракции. Например, следует проверить, соответствует ли указанный выше объем элюента применяемому типу колонок.

2 Размеры и/или форма колбы могут оказывать негативное влияние на выход охратоксина А.

6.4.3 Условия хроматографического анализа

лиз проводят в следующих условиях:

Скорость потока подвижной фазы................1 см 3 /мин;

Длина волны возбуждения флуоресценции.........330 нм;

Длина волны регистрации флуоресценции.........460 нм;

Объем дозирования........................................20 мм 3 .

6.4.4 Градуировка хроматографа

Если применяют колонку по 6.3.11.2 и подвижную фазу по 6.2.10, то хроматографический ана

Градуировку хроматографа проводят при освоении методики и в дальнейшем во всех случаях, когда изменяются условия хроматографического анализа.

Вводят в хроматограф по меньшей мере четыре градуировочных раствора с разными значениями массовой концентрации охратоксина А (см. 6.2.16). Объем дозирования каждого градуировочного раствора должен быть одним и тем же.

Устанавливают градуировочную характеристику как зависимость площади или высоты пика от массы охратоксина А в инжектируемом объеме.

Проверяют линейность установленной градуировочной характеристики, используя коэффициент корреляции (см. 5.3.7). Ежедневно перед началом работы проводят контроль стабильности градуировочной характеристики аналогично 5.3.8, используя при этом градуировочный раствор охратоксина А массовой концентрации 25 нг/см 3 (см. 6.2.16).

6.4.5 Идентификация охратоксина А

Пик охратоксина А идентифицируют путем сравнения значений времени удерживания пиков на хроматограмме пробы и градуировочных растворов. В некоторых случаях может потребоваться ввод пробы с добавкой раствора охратоксина А в подвижной фазе (см. 5.4.4).

6.4.6 Количественное определение

Подготовленный по 6.4.2 раствор пробы сразу же вводят в хроматограф. Объем дозирования должен быть равен объему дозирования градуировочных растворов при проведении градуировки хроматографа (см. 6.4.4).

Измеряют площадь или высоту пика охратоксина А на хроматограмме пробы и при помощи градуировочной характеристики (см. 6.4.4) находят его массу (/n-i, нг) в инжектируемом объеме.

Если значение отклика охратоксина А на хроматограмме пробы выходит за пределы градуировочной характеристики, то подготовленный раствор пробы разбавляют или концентрируют перед вводом в хроматограф, учитывая этот факт при расчете результатов измерений по 6.5.

6.4.7 Подтверждение

При необходимости подтверждают идентификацию пика охратоксина А по его исчезновению и одновременному появлению пика со временем удерживания, совпадающим с временем удерживания пика метилового эфира охратоксина А в результате дериватизации стрифторидом бора.

Отбирают 0,5 см 3 раствора, приготовленного по 6.4.2, в остродонную колбу, упаривают до сухого остатка на ротационном испарителе (см. 5.2.7). Сухой остаток растворяют в 1 см 3 хлористого метилена (см. 6.2.4) и добавляют 2 см 3 раствора трифторида бора в метаноле (см. 6.2.12).

Колбу плотно закрывают пробкой и нагревают на водяной бане при температуре от 50 °С до 60 °С в течение 15 мин. После охлаждения раствор переносят в делительную воронку вместимостью 50 см 3 , содержащую 30 см 3 воды, встряхивают по 30 с тремя порциями хлористого метилена по 10 см 3 каждая. Объединяют органические фазы после каждой экстракции в другой делительной воронке вместимостью 50 см 3 , добавляют для промывания 20 см 3 воды и встряхивают в течение 30 с.

Фильтруют органическую фазу через слой безводного сернокислого натрия (см. 5.2.14) в остродонную колбу, упаривают до сухого остатка, растворяют в 500 мм 3 подвижной фазы (см. 6.2.10) и регистрируют хроматограмму полученного раствора в условиях по 6.4.3.

Для нахождения времени удерживания метилового эфира охратоксина А и проверки полноты дериватизации в указанных выше условиях проводят обработку промежуточного раствора по 6.2.15.

6.5 Обработка результатов испытаний

Массовую долю охратоксина А X, млн" 1 вычисляют по формуле

где Vi - объем толуола, взятый для экстракции по 6.4.2, см 3 (100 см 3);

\/ 3 - объем раствора пробы, подготовленного по 6.4.2, см 3 (1 см 3);

mi - масса охратоксина А, установленная по 6.4.6, нг;

V 2 - объем аликвоты центрифугата по 6.4.2, см 3 (50 см 3);

V 4 - объем дозирования подготовленного раствора пробы, см 3 ;

/77- масса пробы, взятой для испытаний, г;

10" 3 - коэффициент согласования размерности единиц массы.

6.6 Метрологические характеристики

6.6.1 Результаты межлабораторных испытаний по определению точности метода, проведенных в соответствии с ГОСТ ISO 5725-2 , приведены в Приложении Б. Значения, полученные в результате межлабораторных испытаний могут быть не применимы в диапазонах содержаний охратоксина А и для матриц, отличающихся от указанных в приложении Б.

6.6.2 Абсолютное расхождение между двумя результатами единичных испытаний, полученными в условиях повторяемости может превышать предел повторяемости г не более чем в 5 % случаев.

Значения пределов повторяемости г при анализе пшеничной муки из цельного зерна:

/=0,18 мкг/кг (0,00018 млн" 1) при Х=0,41 мкг/кг (0,00041 млн" 1);

/=0,70 мкг/кг (0,00070 млн" 1) при X =1,23 мкг/кг (0,00123 млн" 1).

6.6.3 Абсолютное расхождение между двумя результатами единичных испытаний, полученными в условиях воспроизводимости может превышать предел воспроизводимости R не более чем в 5 % случаев.

Значения пределов воспроизводимости R при анализе пшеничной муки из цельного зерна: R=0,30 мкг/кг (0,00030 млн" 1) при Х=0,41 мкг/кг (0,00041 млн" 1);

R=1,10 мкг/кг (0,00110 млн" 1) при X =1,23 мкг/кг (0,00123 млн" 1).

6.7 Контроль качества результатов измерений - по 5.7.

6.8 Оформление результатов испытаний - по 5.8.

Приложение А (справочное)

Пример хроматограммы

А.1 На рисунке А.1 приведен пример хроматограммы (метод А) концентрата стандартного образца OW-815 «Охратоксин А в молотой пшенице», изготовленного компанией R-Biopharm Rhone Ltd. с массовой долей охратоксина А (0,0049 + 0,0010) млн" 1 .

4 6 8 10 12 14 16 Время, мин

Рисунок А.1 - Пример хроматограммы 2 3

Приложение Б (справочное)

Данные по прецизионности

Б.1 Приведенные в таблице Б.1 данные получены в результате межлабораторных испытаний, проведенных для метода Б в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-2 Институтом имени Макса фон Петтенкофера (Берлин, Германия) на пробах пшеничной муки.

Таблица Б.1 - Данные по прецизионности методики

Наименование Мука пшеничная Мука пшеничная показателя Число лабораторий Число проб Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов Число выбросов Число принятых результатов Среднее значение X, мкг/кг Стандартное отклонение повторяемости s r , мкг/кг Относительное стандартное отклонение повторяемости RSD r Предел повторяемости г, мкг/кг Стандартное отклонение воспроизводимости s R , мкг/кг Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSD r Предел воспроизводимости R, мкг/кг

УДК 543.544.5.068.7:006.354 МКС 67.060 NEQ

Ключевые слова: зерно, зерно продовольственное, зерно фуражное, комбикорма, продукты переработки зерна, методы испытаний, хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, охратоксин А, микотоксины

Подписано в печать 14.04.2016. Формат 60x84V 8 .

Уел. печ. л. 2,33. Тираж 22 экз. Зак. 1070.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru [email protected]

СТАНДАРТ ЗЕРНО И ПРОДУКТЫ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ, КОМБИКОРМА Определение охратоксина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

Grain and products of its processing, mixed feeds.

Determination of ochratoxin A by high performance liquid chromatography

Дата введения - 2015-07-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на зерно и продукты его переработки и устанавливает методы определения содержания охратоксина А с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с флуориметрическим детектированием с применением:

Скрининга проб и очистки методом колоночной хроматографии (метод А) в продовольственном зерне, мукомольно-крупяных изделиях на основе пшеницы, кукурузы, ячменя, ржи, овса и риса, комбикормов и сырья для их производства на зерновой основе (жмых, шрот) в диапазоне измерений массовой доли охратоксина А от 0,0025 до 1,0 млн" 1 ;

Очистки методом твердофазной экстракции (метод Б) в зерне злаков и муке в диапазоне измерений массовой доли охратоксина А более 0,0004 млн" 1 .

Примечание -1 млн" 1 соответствует 1 мг/кг или 1000 мкг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

Из объединенной пробы выделяют лабораторную пробу массой не менее 100 г, которую размалывают до такого состояния, чтобы она проходила через сито с размером диаметра отверстий 1 мм. Выделенную размолотую лабораторную пробу тщательно перемешивают и хранят до проведения испытаний в сухом темном месте в сосуде под крышкой.

Пробы муки испытывают без размалывания.

4 Требования безопасности

При проведении измерений следует соблюдать требования:

Электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и технической документации на хроматограф;

Взрывобезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.010 ;

Пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 ;

Безопасности при работе с вредными веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007 .

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Охратоксин А вызывает поражение почек и печени и предположительно является канцерогеном. Все работы, связанные с подготовкой пробы и приготовлением растворов охратоксина А, следует проводить в вытяжном шкафу с использованием защитной одежды, перчаток и защитных очков. Деконтаминацию стеклянной посуды, контактировавшей с охратоксином А, проводят 4 %-ным раствором гипохлорита натрия.

5 Метод А

5.1 Сущность метода

Метод основан на экстракции охратоксина А из анализируемой пробы продукта подкисленным хлороформом, скрининге проб, которые могут содержать охратоксин А, очистке их экстрактов методом колоночной хроматографии на силикагеле и определении массовой доли охратоксина А с применением ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы, посуда и материалы

5.2.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим или спектрофлуориметрическим детектором, обеспечивающим возбуждение флуоресценции в спектральной области (330 + 20) нм и реги-

страцию интенсивности флуоресценции в спектральной области (465 ± 20) нм. Применяемый детектор должен обеспечивать предел обнаружения охратоксина А не более 5 нг/см 4 5

5.2.2 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1-2011 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0,01 г.

5.2.3 Колонка хроматографическая аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм, имеющая эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику охратоксина А*.

5.2.4 Предколонка того же внутреннего диаметра и заполненная тем же обращенно-фазовым сорбентом,что и аналитическая колонка.

5.2.5 Колонка хроматографическая стеклянная с пришлифованной пробкой длиной 200 мм и внутренним диаметром 10 мм.

5.2.6 Измельчитель проб, обеспечивающий измельчение до частиц размером менее 1 мм, например лабораторная мельница.

5.2.7 Испаритель ротационный типа ИР-1 М2 или аналогичный, снабженный водяной баней с регулятором температуры в диапазоне от 20 °С до 50 °С.

5.2.8 Устройство для перемешивания проб (шейкер), обеспечивающее частоту встряхивания до 120 мин" 1 .

5.2.9 Насос лабораторный вакуумный, мембранный или водоструйный по ГОСТ 25336 , обеспечивающий разрежение от 2,5 до 10 кПа.

5.2.10 Шкаф сушильный, обеспечивающий температуру до 200 °С.

5.2.12 Стандартный образец состава раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 50 мкг/см 5 с допускаемой погрешностью ± 2,5 мкг/см 5 . Допускается применение

стандартных образцов состава раствора охратоксина А в других растворителях, что должно быть учтено при приготовлении исходного раствора по 5.3.3.1.

5.2.13 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696 .

5.2.22 Пипетки градуированные типов 1-3 исполнений 1(1 а) или 2(2а) 2-го класса точности вместимостью 1,2, 5 см 5 по ГОСТ 29227 .

5.2.23 Цилиндры мерные исполнений 1-4 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 250 см 5 по ГОСТ 1770 .

5.2.24 Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 по ГОСТ 1770 .

5.2.25 Колбы остродонные 0-10-14/23 и 0-50-14/23 по ГОСТ 25336 .

5.2.26 Колбы плоскодонные типа П-1 или Кн-1 вместимостью 50, 100, 250 см 5 по ГОСТ 25336 .

5.2.27 Дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 100 до 1000 мм 5 с метрологическими характеристиками по ГОСТ 28311 .

5.2.28 Воронки лабораторные типа В по ГОСТ 25336 .

5.2.30 Пробирка для микропроб однократного применения (типа Эппендорф) вместимостью

5.2.31 Стеклянные емкости вместимостью 50, 250, 1000 см 5 с пришлифованными стеклянными, фторопластовыми или полиэтиленовыми пробками.

5.2.32 Сито с диаметром отверстий 1,0 мм.

5.2.33 Палочки стеклянные.

5.2.34 Часы песочные или таймер.

5.2.35 Фильтры бумажные «красная лента».

5.2.37 Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц от 100 до 200 мкм. Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не

хуже вышеуказанных и вспомогательного оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже вышеуказанных.

5.3 Подготовка к проведению испытаний

5.3.1 Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы моют только серной кислотой по 5.2.20 (без применения других моющих средств), тщательно промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой.

Остальную стеклянную посуду моют горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °С.

5.3.2 Приготовление вспомогательных растворов

5.3.2.1 Приготовление подвижной фазы

В мерную колбу вместимостью 500 см 3 с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой помещают 5 см 3 ледяной уксусной кислоты (см. 5.2.15), 215 см 3 ацетонитрила (см. 5.2.16) и доводят до метки дистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают. Недопустим контакт подвижной фазы с резиной.

Срок хранения смеси при комнатной температуре - не более 1 мес.

5.3.2.2 Приготовление раствора уксусной кислоты объемной долей 1 %

В плоскодонную колбу вместимостью 250 см 3 помещают 200 см 3 дистиллированной воды и 2 см 3 ледяной уксусной кислоты (см. 5.2.15) и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре в стеклянной емкости с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой - не более 1 мес.

5.3.2.3 Приготовление смеси хлороформа и муравьиной кислоты в объемном соотношении

В плоскодонную колбу вместимостью 250 см 3 помещают 200 см 3 хлороформа (см. 5.2.18) и 4 см 3 муравьиной кислоты (см. 5.2.19). Добавляют 10 г безводного сернокислого натрия (см. 5.2.14). Смесь тщательно перемешивают, фильтруют через фильтр «красная лента».

Срок хранения смеси при комнатной температуре в стеклянной емкости с пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой - не более 1 мес.

5.3.3 Приготовление растворов охратоксина А

5.3.3.1 Приготовление исходного раствора охратоксина А с массовой концентрацией 1

Пипеткой отбирают 1 см 3 стандартного образца состава раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 50 мкг/см 3 (см. 5.2.12), помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 и доводят объем до метки ацетонитрилом (см. 5.2.16).

Срок хранения приготовленного раствора в холодильнике при температуре от 2°С до 6°С - не более 6 мес.

При использовании стандартного образца состава раствора охратоксина А в других растворителях аликвоту (1 см 3) упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 °С до 45 °С или в токе азота. Сухой остаток растворяют в 2 см 3 ацетонитрила и перемешивают 1 мин. Затем полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 и разбавляют до метки ацетонитрилом.

Примечание - Допускается приготовление исходного раствора охратоксина А по 6.2.14 -6.2.15 с использованием ацетонитрила вместо подвижной фазы по 6.2.10.

5.3.3.2 Приготовление раствора охратоксина А в ацетонитриле с массовой концентрацией 100

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 5 см 3 раствора охратоксина А с массовой концентрацией 1 мкг/см 3 по 5.3.3.1, что соответствует 1000 нг/см 3 , и доводят объем до метки подвижной фазой по 5.3.2.1.

Срок хранения полученного раствора в холодильнике при температуре от 2°С до 6°С - не более 3 мес.

5.3.3.3 Приготовление градуировочных растворов охратоксина А

Исходный раствор охратоксина А в ацетонитриле по 5.3.3.1 помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 . Объем раствора охратоксина А должен соответствовать требованиям таблицы 1.

Таблица 1

раствора	Объем исходного раствора по 5.3.3.1, см 3	Номинальное значение массовой концентрации, нг/см 3

Содержимое колбы разбавляют до метки подвижной фазой по 5.3.2.1 в соответствии с таблицей 1.

Срок хранения градуировочных растворов - не более семи дней.

Примечание - При необходимости допускается приготовление аналогичным способом растворов охратоксина А других концентраций в диапазоне линейности градуировочной характеристики (см. 5.3.7).

5.3.3.4 Все растворы охратоксина А хранят в холодильнике при температуре не выше 6 °С или в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °С в стеклянных или фторопластовых сосудах.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в растворах по 5.3.3.1 - 5.3.3.3 вычисляют, исходя из значений массовой концентрации охратоксина А по паспорту стандартного образца.

Перед использованием растворы выдерживают до достижения комнатной температуры.

5.3.4 Подготовка стеклянной хроматографической колонки

Стеклянную хроматографическую колонку готовят непосредственно перед проведением испытания.

В стакан вместимостью 50 см 3 помещают (1,0 ± 0,1) г силикагеля (см. 5.2.37), добавляют от 10 до 15 см 3 хлороформа (см. 5.2.18) и тщательно перемешивают. Полученную суспензию выдерживают в стакане в течение 4-5 мин и затем в несколько приемов через воронку диаметром 25 или 36 мм переносят суспензию силикагеля в колонку, предварительно поместив на ее дно кусочек ваты.

После оседания силикагеля в колонке на него сверху насыпают слоем около 2 г безводного сернокислого натрия (см. 5.2.14).

В процессе работы с колонкой нельзя допускать высыхания сорбента, для чего необходимо поддерживать над осушителем слой растворителя. В состоянии готовности колонка должна быть заполнена хлороформом выше уровня сорбента, закрыта стеклянной пришлифованной пробкой, а выход колонки должен быть погружен в хлороформ.

Подготовленную колонку используют однократно.

5.3.5 Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации.

Устанавливают рабочие длины волн возбуждения и регистрации флуоресценции (см. 5.2.1). Скорость подачи подвижной фазы задают в зависимости от типоразмеров колонки, руководствуясь указаниями изготовителя хроматографа и колонки. Например, для колонки, указанной в 5.2.3, рекомендуемая объемная скорость подвижной фазы составляет 200 мм 3 /мин. При наличии термостата колонок устанавливают температуру (25 ± 1) °С.

5.3.6 Условия хроматографического анализа

Если используют хроматографическую колонку по 5.2.3 и подвижную фазу по 6.2.10, то хроматографический анализ проводят в следующих условиях:

Длина волны возбуждения флуоресценции..................330 нм;

Длина волны регистрации флуоресценции...................465 нм;

Скорость потока подвижной фазы.......................200 мм 3 /мин;

Объем дозирования................................................20 мм 3 ;

Температура термостата колонки (при его наличии)...(25 ± 1) °С.

При использовании колонок других типоразмеров скорость потока подвижной фазы и объем дозирования выбирают в соответствии с указаниями изготовителя хроматографа и колонки.

5.3.7 Градуировка хроматографа

Диапазон линейности градуировочной характеристики составляет от 10 до 100 нг/см 3 . В качестве образцов для градуировки хроматографа используют градуировочные растворы охратоксина А по 5.3.3.3.

Регистрируют не менее двух хроматограмм каждого градуировочного раствора и проводят градуировку хроматографа, устанавливая параметры градуировочной характеристики и время удерживания охратоксина А, используя программное обеспечение к хроматографу.

Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации охратоксина А в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 5.3.3.3).

Градуировку считают приемлемой, если:

Коэффициент корреляции не менее 0,998;

Относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации охратоксина А от фактического значения не более + 10 %. Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5 %.

5.3.8 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом

В качестве контрольного раствора используют раствор охратоксина А в подвижной фазе, приготовленный аналогично 5.3.3.3. Массовую концентрацию охратоксина А в контрольном образце выбирают, исходя из предполагаемого содержания охратоксина А в испытуемых пробах; рекомендуется использование раствора охратоксина А массовой концентрации 20 нг/см.

Регистрируют не менее двух хроматограмм контрольного раствора и идентифицируют пик охратоксина А по времени удерживания при ширине окна идентификации 5 %, внося при необходимости программную коррекцию времени удерживания пика, и при помощи градуировочной характеристики рассчитывают массовую концентрацию охратоксина А для каждого ввода.

Сходимость значений времени удерживания и значений массовой концентрации охратоксина А проверяют по формулам:

где U и t 2 - время удерживания пика охратоксина А на первой и второй хроматограммах соответственно, мин;

I - среднеарифметическое значение U и t 2 , мин.

Ск: и С«2 - массовые концентрации охратоксина А в контрольном растворе по первой и второй хроматограммам соответственно, нг/см 3 ;

С к - среднеарифметическое значений С К: и С ю, нг/см 3 .

Градуировочная зависимость признается стабильной, если выполняется условие

где С - массовая концентрация охратоксина А в контрольном растворе, нг/см.

Если условие (3) не выполняется, то процедуру контроля повторяют. Результаты повторного контроля считают окончательными, и градуировку хроматографа по 5.3.7 проводят заново.

Примечание - Повторная градуировка хроматографа, как правило, требуется при изменении эффективности хроматографической системы или чувствительности детектора (например, после проведения ремонта или длительного простоя хроматографа).

5.3.9 Контроль холостой реактивной пробы

Испытание холостой реактивной пробы проводят перед испытанием исследуемых проб.

В плоскодонную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 30 см 3 хлороформа и 2,5 см 3 раствора уксусной кислоты по 5.3.2.2, тщательно перемешивают и осторожно отбирают из нижнего слоя 20 см 3 хлороформа в остродонную колбу для упаривания вместимостью 50 см 3 , не допуская попадания в нее воды.

Остродонную колбу помещают в ротационный испаритель и упаривают в вакууме до сухого остатка при температуре водяной бани от 40 °С до 45 °С. Продолжают выполнять все операции по 5.4.3, получая таким образом концентрат холостой пробы. Проводят хроматографическое исследование полученного концентрата по 5.4.4. Если на хроматограмме присутствуют пики, по времени удерживания близкие к пику охратоксина А, то находят и устраняют причины загрязнения холостой пробы (реактивы или посуда).

Примечание - Наиболее распространенной причиной неудовлетворительного результата контроля холостой пробы является недостаточная чистота хлороформа, который может быть загрязнен примесями, имеющими близкие к охратоксину А значения времени удерживания. Такой хлороформ необходимо заменить или подвергнуть тщательной перегонке, собирая среднюю фракцию с температурой кипения от 60 °С до 62 °С.

5.3.10 Учет потерь охратоксина А в процессе подготовки проб

В плоскодонную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 30 см 3 хлороформа (см. 5.2.18) и 2,5 см 3 раствора уксусной кислоты (см. 5.3.2.2), вносят 0,25 см 3 раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 100нг/см 3 (см. 5.3.3.2). Тщательно перемешивают и осторожно отбирают 20 см 3 хлороформного (нижнего) слоя в остродонную колбу для упаривания вместимостью 50 см 3 , не допуская попадания в нее воды. Упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 °С до 45 °С.

Далее продолжают выполнять все операции по 5.4.3, проводят хроматографический анализ полученного концентрата по 5.4.4 и, используя градуировочную характеристику по 5.3.7, вычисляют массовую концентрацию охратоксина А в концентрате.

Затем вычисляют коэффициент прохождения охратоксина А п по формуле

(4)

V 0 - объем раствора охратоксина А по 5.3.3.2, отобранный для приготовления контрольного

образца, см 3 (0,25 см 3).

Коэффициент прохождения охратоксина А определяют не менее трех раз на стадии освоения методики и затем при смене партий реактивов. Полученные значения должны соответствовать следующим требованиям:

Каждое из полученных значений не менее 0,7;

Относительное значение размаха полученных значений соответствует условию

I макс Умин I q jq ^

где Дмакс и т| мин - наибольшее и наименьшее из полученных значений коэффициента прохождения охратоксина А;

г) - среднеарифметическое полученных значений коэффициента прохождения охратоксина

Если оба этих условия выполняются, то среднеарифметическое значение коэффициента прохождения охратоксина А используют при расчете результатов определения по формуле (9). В противном случае находят причины потерь охратоксина А и повторяют определение коэффициента прохождения.

Примечания

1 Причиной неудовлетворительного результата определения коэффициента прохождения может быть повышенная скорость прохождения элюента через колонку.

2 Следует обратить особое внимание на необходимость определения коэффициента прохождения охратоксина А при смене партии силикагеля. Рекомендуется при переходе к новой партии силикагеля провести оптимизацию объемов элюентов, используемых при колоночной очистке проб (см.5.4.3), добиваясь наибольшего значения коэффициента прохождения. Найденные при этом объемы используют при очистке проб на колонках, изготовленных из данной партии реагента.

3 Рекомендуется уточнить для конкретных матриц коэффициент прохождения охратоксина А с использованием стандартных образцов состава продукции с аттестованным значением массовой доли охратоксина А либо путем анализа «чистой» пробы (охратоксин А в пробе не обнаруживается), в которую внесена добавка охратоксина А. Анализируют стандартный образец (пробу с добавкой охратоксина А) согласно 5.4.1 - 5.4.4. Вычисляют результат анализа (см. 5.5) и находят коэффициент прохождения охратоксина А как отношение полученного результата к аттестованному значению массовой доли охратоксина А в стандартном образце или к массовой доле охратоксина А в добавке.

5.4 Проведение испытаний

5.4.1 Экстракция охратоксина А из пробы

Пробу измельченного продукта массой (5,00 ± 0,01) г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см 3 . Добавляют 30 см 3 хлороформа (см. 5.2.18) и 2,5 см 3 раствора уксусной кислоты (см. 5.3.2.2), интенсивно перемешивают 30 мин. Пропускают полученный экстракт через бумажный складчатый фильтр «красная лента», отбирая 20 см 3 фильтрата для упаривания.

Если не удается отобрать 20 см 3 фильтрата, то отбирают максимально возможный объем, измеряют его и используют полученное значение в формуле (9).

Переносят полученный фильтрат в остродонную колбу вместимостью 50 см 3 и упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 °С до 45 °С.

Сухой остаток обрабатывают по 5.4.2 или 5.4.3 в зависимости от цели испытания - скринингом проб или количественным определением массовой доли охратоксина А в пробе, в которой при скрининге выявлен пик, идентифицированный как пик охратоксина А.

Примечание - При испытаниях проб, для которых есть основание полагать, что они заражены охратоксином А, допускается сразу переходить к очистке на колонке по 5.4.3, минуя скрининг.

5.4.2 Проведение скрининга проб

Сухой остаток, полученный по 5.4.1, растворяют в 0,5 см 3 подвижной фазы по 5.3.2.1 и перемешивают 1 мин. Затем добавляют 3 см 3 гексана (см. 5.2.17) и снова интенсивно перемешивают. После расслоения двух несмешивающихся между собой фаз аккуратно переносят приблизительно 0,3 см 3 нижнего слоя в пробирку для микропроб однократного применения вместимостью 1,5 см 3 (пробирка типа Эппендорф) или аналогичную.

Регистрируют хроматограмму полученного раствора по 5.4.4 в день проведения испытаний. Если на хроматограмме обнаруживают пик, идентифицируемый программным обеспечением к хроматографу как пик охратоксина А, то повторяют испытания пробы, включив в обязательном порядке очистку по 5.4.3.

При отсутствии пика, идентифицируемого как пик охратоксина А, делают вывод об отсутствии охратоксина А в пробе на уровне нижней границы диапазона измерений (0,0025 млн" 1).

5.4.3 Очистка пробы и приготовление ее концентрата

Сухой остаток по 5.4.1 растворяют в 1 см 3 хлороформа.

Подготавливают стеклянную колонку по 5.3.4. Дают хлороформу стечь до уровня безводного сернокислого натрия и наносят на колонку полученный раствор. Остродонную колбу, в которой проводили упаривание экстракта, ополаскивают два раза по 1 см 3 хлороформа, который также наносят на колонку. После этого промывают колонку 10 см 3 гексана, элюат отбрасывают.

Затем через колонку пропускают 30 см 3 смеси хлороформа с муравьиной кислотой (см. 5.3.2.3) со скоростью не более чем одна капля в секунду, элюируя охратоксин А. Весь элюат собирают в остродонную колбу и упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 °С до 45 °С.

Сухой остаток растворяют в 0,5 см 3 подвижной фазы (см. 5.3.2.1) и перемешивают 1 мин. Затем добавляют 3 см 3 гексана и снова интенсивно перемешивают. После расслоения двух несмешивающихся между собой фаз аккуратно переносят приблизительно 0,3 см 3 нижнего слоя в пробирку для микропроб однократного применения вместимостью 1,5 см 3 (пробирка типа Эппендорф) или аналогичную. Полученный концентрат используют для хроматографических измерений по 5.4.4 в день проведения испытаний.

Например, колонка Lichrospher® 100 RP 18, являющаяся примером коммерческого продукта, удовлетворяющего указанным требованиям. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.

Пик соответствует содержанию охратоксина А, равному 0,0042 млн" .

* Пример коммерческого продукта, удовлетворяющего указанным требованиям - хроматографическая колонка внутренним диаметром 2,1 мм и длиной 120 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом Кромасил С-18 с размером частиц 5 мкм, снабженная предколонкой длиной 25 мм. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.